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Die Regressionsanalyse zeigt puma basket beige ferner, dass die Koexpression von EGFR allein, PUMA allein und EGFR / PUMA signifikant mit dem Gliomgrad korreliert (2a). Zwei repräsentative immungefärbte Gliome sind in 2b gezeigt, in denen ein GBM (oberes Feld) sowohl für EGFR / EGFRvIII als auch für PUMA eine positive Färbung zeigt und im Gegensatz dazu ein Grad II-Gliom (unteres Feld) für beide Proteine   negativ färbt. Der im EGFR / EGFRvIII-IHC verwendete Antikörper erkennt ein C-terminales Epitop, das sowohl im EGFR- als auch im EGFRvIII-Rezeptor vorhanden ist, und aufeinanderfolgende Tumorschnitte wurden in diesen Studien verwendet. Der hohe Grad der EGFR / EGFRvIII-PUMA-Co-Expression in primären GBM-Proben stimmt mit den Beobachtungen in 1 mit den GBM-Zelllinien überein.

Um zu untersuchen, ob PUMA für die Induktion von Apoptose in GBM essentiell ist, wurde PUMA-spezifische siRNA verwendet, um die PUMA-Expression und die Reaktion von U87MG-GBM-Zellen, die sehr niedrige EGFR-Spiegel exprimieren, puma basket black auf Anisomycin, einen potenten Induktor von, herunter zu regulieren Apoptose [38] wurde untersucht. Wie in 3a gezeigt, zeigte der TUNEL-Assay, dass PUMA Knockdown U87MG-Zellen resistent gegen Apoptose (2,5%) macht, induziert durch 48-stündige Anisomycin-Behandlungen. Im Gegensatz dazu erfahren mit der Kontroll-siRNA transfizierte U87MG-Zellen eine signifikante Anisomycin-induzierte Apoptose (45,5%). puma basket bow In dem Assay repräsentieren die gelben fusionierten Signale nuklear fragmentierte DNA.

Wie erwartet zeigten unbehandelte Zellen keinen Hinweis auf Apoptose (Daten nicht gezeigt). Das Western Blot (3b) zeigte, dass die PUMA-Expression durch die PUMA-spezifische siRNA spezifisch und effizient herunterreguliert wurde. Auswirkungen der Herunterregulierung der PUMA-Expression und der erhöhten EGFRvIII-Expression auf die Induktion von Apoptose in GBM-Zellen. Das Ausmaß der Apoptose wird wie folgt berechnet: (Anzahl der apoptotischen Kerne) / (Gesamtanzahl der Kerne). In beiden Panels wurden 250-300 Zellen in jedem Experiment untersucht und drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt, um Mittelwerte und Standardabweichungen abzuleiten. (A) PUMA-Expressions-Knockdown macht GBM-Zellen puma basket classic damen resistent gegen Apoptose, wie durch den TUNEL-Assay angezeigt.

Nach der Behandlung mit Anisomycin gab es nur 3,1% Apoptose in U87MG-EGFRvIII-Zellen. Im Gegensatz dazu zeigten die isogenen U87MG-Vektorzellen mit niedrigem EGFR-Gehalt eine massive Apoptose (49,8%), ähnlich wie bei der PUMA-Herunterregulierung (45,5%). Die Ergebnisse in 3 zeigen zusammengenommen, dass die GBM-Apoptose durch PUMA positiv reguliert und durch EGFR / EGFRvIII negativ beeinflusst wird, was darauf hindeutet, dass die PUMA- und EGFR / EGFRvIII-Pfade funktionell aber umgekehrt mit der Apoptose in GBM-Zellen verbunden sind. 4 zeigen, dass in GBM-Zellen EGFR / EGFRvIII und PUMA unter nicht belasteten Bedingungen einen Komplex bilden und dass der Komplex auch nach der Behandlung mit dem Apoptose-Induktor Staurosporin (ST) erhalten bleibt.

Diese Beobachtungen wurden in stabilen Transfektanten von U87MG-EGFRvIII (oberes Feld) und U87MG-EGFR (mittleres Feld) sowie in T98G-GBM-Zellen gefunden, die hohe Mengen an endogenem EGFR (unteres Feld) exprimieren. Als Negativkontrollen verwendetes Maus-IgG ergab kein Signal, was auf die Spezifität des Assays hinweist. Es ist bemerkenswert, dass die endogenen EGFR-Spiegel durch Staurosporin in T98G-Zellen leicht verringert wurden (rechtes Feld). Dies wird möglicherweise auf die Caspase-vermittelte Spaltung nach Staurosporin-Behandlung zurückgeführt [39]. Sowohl EGFR als auch EGFRvIII existieren im puma basket grau Komplex mit PUMA konstitutiv und die Wechselwirkungen werden unter apoptotischem Stress aufrechterhalten.

In Kontroll-siRNA-behandelten natürlichen T98G-GBM-Zellen ist PUMA hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. In EGFR-spezifischen siRNA-behandelten Zellen beobachteten wir einen deutlichen Anstieg des mitochondrialen PUMA (linkes Feld). EGFR-spezifische siRNA reduzierte wirksam die EGFR-Expression, wie durch die Western-Blots gezeigt (rechtes Feld). Lamin B: Kernprotein. ME: mitochondriale Extrakte. NME: nicht mitochondriale Extrakte. (D) PUMA wird im Zytoplasma EGFR-exprimierender menschlicher Brustkrebszellen sequestriert. MDA-MB-468-Zellen, von denen bekannt ist, dass sie hohe Mengen an endogenem EGFR exprimieren [34], wurden mit und ohne Staurosporin behandelt, in mitochondriale und nicht mitochondriale Fraktionen fraktioniert und Proteinextrakte wie zuvor beschrieben analysiert.

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